Анализ ДНК

Сравнительная геномная гибридизация (CGH) и измерение теломер

Количественная оценка содержания ДНК в хромосомах

Сравнительная геномная гибридизация (CGH) – это технология анализа изменений числа копий относительных уровней плоидности ДНК в испытательном образце по сравнению с эталонным образцом. Это достигается использованием сравнения флуоресценции при гибридизации in situ. Методика CGH часто используется для оценки различий между хромосомными наборами солидных опухолей и нормальных тканей. CGH-анализ может выполняться с помощью специализированного модуля CGH к системе Isis.

Теломеры – это области повторяющихся последовательностей на каждом конце хромосомы, защищающие концы хромосом от разрушения и от слияния с соседними хромосомами. Длина теломер является объектом многочисленных исследований, поскольку предполагается ее связь со старением и с развитием раковых заболеваний. Система Isis способна оценивать сигналы теломер на основе их интенсивности.

CGH

Модуль анализа сравнительной геномной гибридизации (CGH) поставляется как опция, модуль к системе Isis. Модуль CGH выявляет несбалансированные изменения количества копий (добавки и потери) в заданном образце геномной ДНК. ДНК образца и эталонная ДНК помечаются различными флуорохромами. Оба образца смешиваются и согибридизуются с нормальными метафазными хромосомами.

Количественный анализ соотношения интенсивностей цветов вдоль оси каждой из хромосом позволяет оценить различия в числе копий ДНК в образце по отношению к эталону. В системе Isis легко производится кариотипирование метафаз, и каждый кариотип можно сразу же сверять с контрольными профилями. Анализ производится путём усреднения всех хромосом заданного класса по всем кариограммам случая или даже нескольких случаев. Доверительный интервал для профиля может быть задан в виде фиксированного значения, в виде множителя для стандартного отклонения, либо как предел вероятности. Одновременное отображение добавок и делеций в различных случаях позволяет непосредственно сравнивать результаты разных пациентов или препаратов и выявлять общие добавки и делеции.

Качество гибридизации имеет решающее значение для CGH-анализа. Для надежной воспроизводимости результатов качество CGH-изображения выводится в виде гистограммы относительных значений и служит мерой качества подготовки препарата. Хромосомы одного класса с разной степенью конденсации выпрямляются и нормируются по длине, что повышает точность CGH-измерений. Измерение с высоким разрешением, проводимое вдоль оси хромосомы, гарантирует обнаружение даже небольших отклонений (от 3 Mbp).

Возможно интерактивное исключение клеток с артефактами. Индивидуальный профиль каждой хромосомы можно выделить для выявления ошибочных профилей. После выявления ошибочных профилей соответствующие метафазы можно временно исключить из анализа. Для каждого класса хромосом отображаются усредненные профили анализируемой и эталонной ДНК, включая число проанализированных хромосом, и могут быть рассчитаны по одному или различным случаям. Рядом с идиограммами можно выводить столбчатые диаграммы, показывающие добавки или делеции. Это упрощает выявление в исследуемой ДНК областей с одинаковыми добавками/делециями.

Требуется помощь?

Теломеры

Теломеры хромосом, помеченных общетеломерными FISH зондами, могут автоматически анализироваться системой Isis. Все больший интерес в цитогенетике вызывает количественное определение теломерной ДНК в образцах раковых клеток, поскольку теломеры существенно важны для стабильности и репликации хромосом. Предполагается также, что теломеры играют важную роль в процессах старения и апоптоза.

В системе Isis сигналы теломер автоматически определяются и анализируются по их интенсивности. Области измерений можно задавать динамически с помощью мыши. Эталонные сигналы, например, от центромерных зондов, могут измеряться в том же цветовом канале, что и теломерные сигналы, либо в другом, при использовании другого флуорохрома. Для нормирования результатов данные анализа теломер делятся на интенсивность эталонного сигнала. Такой метод позволяет компенсировать неоднородность гибридизации между отдельными метафазами. Интенсивность каждого пикселя корректируется по интенсивности фона, а в областях теломер интенсивности во время измерения суммируются.

Результаты измерений теломер автоматически сохраняются в текстовых файлах. Они могут быть выведены на экран и просуммированы для всех проанализированных кариограмм. Данные выводятся на экран либо в виде таблицы, либо в графическом виде.

Требуется помощь?