Анализ комет и разрывов

Анализ повреждений ДНК на основе одиночных клеток

Автоматизация количественного анализа повреждений ДНК на основе одиночных клеток.

Специалисты по токсикологии и по радиационной биологии в настоящее время имеют возможность выбора из множества признанных тестов для оценки повреждений ДНК. Однако, большинство из этих тестов основаны на подсчёте событий, которые только косвенно связаны с исходными повреждениями. Хромосомные аберрации и микроядра, к примеру, вызываются разрывами ДНК, но структура, видимая под микроскопом, является следствием сложных процессов в ядре клетки. Однако, анализ комет и γ-H2AX гистона даёт возможность непосредственно оценить повреждения на уровне одной клетки. Как часть своего комплекта методов в области токсикологии, компания MetaSystems автоматизировала оба анализа в системе Metafer.

Анализ комет

Анализ комет (гель-электрофорез одиночных клеток) – это метод получения степени фрагментации ДНК в отдельных клетках. Он широко используется для оценки повреждений ДНК, вызванных химическими веществами или радиацией, например, для проверки индивидуальной чувствительности к ионизирующей радиации у раковых больных. Исследование включает в себя анализ изображения миграции в агарозном геле, вызванной фрагментацией ДНК. Чем более фрагментирована ДНК, тем далее мигрируют фрагменты ДНК, образуя структуру, напоминающую хвост кометы. Поэтому количественная оценка повреждений основана на расчёте свойств "голов" (самих клеток) и "хвостов" (мигрирующих фрагментов).

Metafer автоматически обнаруживает и выбирает клетки в образцах гель-электрофореза одиночных клеток. Все выбранные клетки анализируются по всем критериям, важным для анализа комет (момент хвоста, момент хвоста по методу Olive, процент ДНК в хвосте, размеры хвоста и головы и многое другое). Измеряются параметры фона изображений, и полученные данные могут быть скорректированы в случае неравномерного фона. Кометы обнаруживаются на основе морфологических критериев, заданных пользователем, и разности характеристик между клетками и фоном. Обнаруженные кометы отображаются в галерее клеток, и каждая комета может быть перемещена под объектив микроскопа одним щелчком мыши. Данные отображаются в виде удобных гистограмм и/или диаграмм разброса данных, которые непрерывно обновляются по мере сканирования. Система Metafer поддерживает различные значения экспозиции при съёмке изображений. Изображения имеют расширенный динамический диапазон для повышения точности и надёжности измерений.

Metafer – превосходная система для автоматизированного анализа комет с высокой производительностью. Она поддерживает изменение размеров препаратов, например, для использования мультигелевых образцов.

В состав Metafer входит также лицензия на интерактивную программу анализа методом комет. Эта программа даёт те же возможности анализа, что и Metafer, и она доступна в виде автономной системы. При использовании возможностей анализа сигналов системы Metafer имеется намного больше возможностей для автоматического выбора целевой клетки. К примеру, такая система может автоматически обнаруживать кометы Hedgehog и отличать их результаты от других клеток.

Требуется помощь?

Гамма-H2AX-гистоны

Двойные разрывы нитей (DSB) – наиболее опасное повреждение ДНК, которое, если не произойдёт репарация, может иметь тяжелые последствия для выживания клетки. Известно, что это приводит к хромосомным аберрациям, неустойчивости генома и к гибели клетки. На возникновение DSB влияют различные физические, химические и биологические факторы. В ответ на возникновение DSB происходит фосфорилирование на серине 139 гистона H2AX, белка, участвующего в формировании нуклеосом и, тем самым, структуры ДНК, который после этого называется γ-H2AX. Поскольку γ-H2AX распространяется на большое расстояние от точки DSB, и поскольку имеются специфические антитела к γ-H2AX, точки DSB становятся видимыми как дискретные объекты. Количественная оценка объектов γ-H2AX может использоваться для обнаружения генотоксических эффектов различных вредных воздействий, включая ионизирующую радиацию.

Поскольку объекты γ-H2AX под микроскопом выглядят как точечные сигналы, их можно автоматически анализировать, используя функционал Metafer для подсчёта сигналов. Однако, в отличие от точек в FISH-анализе, объекты γ-H2AX могут иметь различные размеры, а в клетках, подвергшихся большой дозе воздействия, вызывающего DSB, могут сливаться в крупные пятна флуоресцентной окраски. Metafer подсчитывает объекты в клетке непосредственно и автоматически, но дает также возможность ввести в измерение весовой коэффициент. Это позволяет адаптировать условия счёта к собственным стандартам подсчёта. Адаптация может производиться с использованием данных проверочного эксперимента с известными кривыми зависимости эффекта от дозы.

Требуется помощь?