コメット アッセイ / 焦点

単細胞ベースの DNA 損傷解析

単細胞ベースの定量的 DNA 病変解析です。

毒物学者や放射線生物学者は現在、多くの実績ある試験から選んで DNA 損傷を評価することができます。しかし、これら多くの試験は、元の病変とは間接的な関係しかない事象をカウントすることをベースにしています。例えば染色体異常および小核は、 DNA 切断により発生するものですが、顕微鏡で観察できる構造は複雑な細胞プロセスの結果です。しかし、コメット アッセイおよび  γ-H2AX 焦点解析の場合は、単細胞レベルで損傷を直接評価する機会があります。MetaSystems は、毒物ポートフォリオの一環として、これら両方のアッセイを Metafer で自動化しています。

コメットアッセイ

コメット(単細胞ゲル電気泳動)アッセイは、単細胞の DNA 断片化量を取得する方法です。これは例えば癌患者の電離放射線に対する感応度といったような、薬品または放射能による DNA 損傷を評価するために幅広く活用されています。このアッセイは、アガロースゲルの分裂した DNA により引き起こされる泳動パターンの画像解析を伴います。分裂した DNA の数が多ければ多いほど、より多くの DNA 断片が泳動し、結果としてコメットの尾に似た構造が構成されます。損傷の定量化は、「頭」(実際の細胞)と「尾」(泳動した断片)の計算に基づいています。

Metafer は、単細胞ゲル電気泳動試料を自動的に検出して選択します。選択された細胞は全て、コメット アッセイで重要視されているすべての特徴(尾の動作、オリーブ核尾動作、尾の %DNA、尾と頭の寸法、その他多数)について解析されます。画像の背景状態が測定され、結果データは不均等な背景について修正することができます。コメットは、ユーザ定義された形態基準ならびに細胞と背景の間の閾値に基づいて検出されます。検出されたコメットは細胞ギャラリーに表示され、それぞれのコメットの位置はマウスのクリックひとつで再配置することができます。データは走査の進捗に応じて継続的に更新される便利なヒストグラムおよび/または散布図に表示されます。Metafer は、画像取得について複数の露出時間をサポートしています。画像には、より正確で信頼性の高い測定を可能にするため、拡張されたダイナミックレンジが割り当てられています。

Metafer は、自動化された高度な処理によるコメット アッセイ解析に最適なシステムです。複数ゲル試料の使用のようなスライド寸法の変更に対応しています。

Metafer には、インタラクティブなコメット アッセイ解析ソフトウェアのライセンスも標準装備されています。ソフトウェアには Metafer と同様の解析オプションが提供されており、それはスタンドアローンシステムとしても利用可能です。Metafer の信号解析機能を用いると、自動目標細胞選択にはより多くのオプションが提供されます。例えば、システムはヘッジホッグ コメットを自動的に検出することができ、他の細胞の結果と区別します。

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ガンマ-H2AX-焦点

二本鎖切断(DSB)は、修復しないままにしておくと細胞の残存に厳しい結果をもたらす有害な DNA 病斑で、染色体異常、ゲノム不安定性、および細胞死を起こすことで知られています。DSB 誘導には、さまざまな物理的、化学的、そして生物学的な要因が関わっています。ヒストン H2AX は、ヌクレオソームの構成、従って DNA の構造に関与するタンパク質であり、セリン 139 でリン酸化し、DSB の構成の反応で γ-H2AX となります。γ -H2AX は DSB サイトからかなりの距離まで拡張し、また特定の γ-H2AX 抗体もあるため、 DSB は分離した焦点として視覚化することができます。γ-H2AX 焦点の定量化は、電離放射線を含む、さまざまな有害物質の遺伝毒性効果の検出に用いることができます。

γ -H2AX 焦点は顕微鏡観察ではスポット形の信号に見えるため、 Metafer の信号カウント機能で自動的に解析することができます。FISH スポットと比較して、γ-H2AX 焦点には寸法が変動する傾向があり、また大量の DSB 誘導剤に暴露した細胞の蛍光染色の大きな区画に融合する傾向があります。Metafer は細胞核にある焦点を自動的に直接カウントしますが、測定に重量項を追加する可能性も提供します。すると、スコアリング条件を自身のスコアリング標準に適合させることが可能になります。適合化は、有効な線量効果曲線がある実証実験のデータを使って行うことができます。

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