Test des micronoyaux

Automatisation de l'analyse des micronoyaux

Analyse à l'aide de Metafer de micronoyaux in-vitro et in-vivo dans des prélèvements en biodosimétrie, toxicologie et pour la recherche sur la mutagénécité.

Les tests de micronoyaux (MN) sont utilisés pour le screening en toxicologie et en radiodosimétrie pour quantifier la capacité d´altération de l´ADN d´un agent. Les tests sont désormais reconnus comme les plus fructueux et les plus fiables pour l´analyse de carcinogènes génotoxiques. Il existe deux modèles majeurs de tests MN, qui sont (a) le test MN utilisant la méthode du blocage de la cytokinèse (désigné comme test MN in-vitro ci-dessous), et (b) le test MN utilisant des érythrocytes de rongeurs (désigné comme test MN in-vivo ci-dessous).

Metafer est capable de faire une acquisition d´image et une analyse d´image complète, automatisée et fiable pour les deux tests. L´analyse MN automatisée est conforme aux directives OCDE correspondantes et peut être effectuée en accord avec les bonnes pratiques de laboratoire (BPL).

Test MN in-vitro

L´analyse des micronoyaux avec le méthode du blocage de la cytokinèse est un système complet pour mesurer l´altération de l´ADN, la cytostase et la cytotoxicité. Le test consiste à rajouter de la cytochalasine-B (un inhibiteur du fuseau mitotique qui empêche la cytokinèse) à des cultures cellulaires. Ceci a pour conséquence que les cellules ayant complété une division nucléaire sont identifiées par leur apparence bi-nucléaire. Les évènements d´endommagement de l´ADN sont comptés specifiquement dans des cellules bi-nuclées qui ne se sont divisées qu´une seule fois.

Metafer balaie les prélèvements MN in-vitro automatiquement, identifie les cellules bi-nuclées (des cellules qui ont traversé une seule division après le traitement) de façon fiable et les analyse pour la présence de micronoyaux. Tous les noyaux mono-nuclées sont comptés simultanément, fournissant une information sur la vitesse de prolifération de la culture.

Les résultats de l´analyse sont affichés dans une galerie de cellules, montrant chaque cellule individuelle analysée ensemble avec le nombre de micronoyaux comptés. L´ensemble des données est résumé sous forme d´histogramme. Les utilisateurs peuvent sélectionner les classes de cellules positives pour un ou plusieurs micronoyaux, ils peuvent filtrer la galerie en fonction de leur sélection et ainsi confirmer rapidement les résultats automatiques sans la nécessité de faire défiler toutes les cellules. La morphologie des cellules et des micronoyaux est analysée à l'aide d'ensembles de paramètres modifiables par l´utilisateur. L´optimisation des paramètres et donc le réglage des standards de comptage se fait à l´aide d´un outil d´auto-optimisation. L´auto-optimisation peut aussi être utilisée pour trouver les meilleurs paramètres de traitement d´image.

Le comptage de micronoyaux à l'aide de Metafer est non seulement très robuste, mais également extrêmement rapide. Ce module est devenu un outil très important pour la radiodosimétrie. Plusieurs études indépendantes dans des revues scientifiques ont démontré que le comptage de micronoyaux avec Metafer est un outil utile pour l´estimation de la dose radioactive, particulièrement dans des scénarios de grands accidents pour lesquels l´implication d´une source de radiation ionisante est supposée.

En toxicologie , les effets cytostatiques de la substance testée sont mesurés en évaluant le ratio de cellules mono-, bi-, et multi-nuclées (CBPI). Cette méthode fait également partie de la directive OCDE correspondante (directive OCDE #487). Metafer analyse automatiquement le status des cellules par une analyse morphologique des noyaux et calcule le CBPI. Le système est entièrement conforme à la directive OCDE correspondante et aussi aux directives BPL.

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Test MN in-vivo

Le test MN in-vivo (test MN utilisant des erythrocytes de rongeurs) utilise normalement de la moelle ou du sang périphérique de rongeurs qui ont été traités avec la substance à tester. Les globules rouges du prélèvement sont classifiés comme érythrocytes polychromatiques (PCE; immature) ou normochromatiques (NCE; mature). Dans les PCE, les noyaux principaux ont été expulsés et des MN demeurent dans le cytoplasme par ailleurs anucléé. Une augmentation de la fréquence des érythrocytes polychromatiques micronuclées dans les animaux traités est une indication d´induction d´altération des chromosomes. Les PCE et les NCE se distinguent par la couleur (après avoir appliqué une coloration May-Gruenwald + Giemsa), et le ratio entre les deux populations contient des informations sur des ralentissements dans le cycle cellulaire causés par les effets secondaires toxiques de la substance à tester. Il est important de savoir que l´automatisation du comptage pour le test MN in-vivo nécessite des prélèvements préparés à partir de solutions cellulaires purifiées par colonne et qu´il est recommandé de préparer les prélèvement par cyto-centrifugation. Seule cette façon de préparer les lames assure une analyse automatique fiable et sans erreurs.

L´automatisation du test MN in-vivo avec Metafer est effectué selon un flux de travail complètement sans surveillance. Le système capture des images du prélèvement automatiquement et analyse la plage d´intensité de la coloration. En se référant à la qualité de la coloration, les PCE et NCE sont automatiquement distingués les un des autres selon leur couleur. Le système est suffisamment robuste pour s´adapter à des variations de qualité de la coloration et à des ratios différents de PCE et de NCE (par exemple si on utilise du sang périphérique au lieu de la moelle). Une fois que les couleurs pour les PCE et les NCE sont définies, chaque cellule est attribuée à l´une des classes et les micronoyaux sont détectés. Typiquement, le système peut scanner et analyser plus de 1000 cellules par minute.

L´automatisation du test MN in-vivo avec Metafer est entièrement conforme à la directive OCDE correspondante (directive OCDE #474), et aux directives BPL

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