Comet Assay / Foci

Analyse de l´altération de l'ADN basée sur des cellules individuelles.

Automatisation de l´analyse quantitative de lésions d'ADN basée sur des cellules individuelles.

De nos jours, les toxicologues et les radiobiologistes peuvent choisir entre de nombreux tests établis pour évaluer l'altération de l´ADN. Cependant, plusieurs de ces tests sont basés sur le comptage d´évènements qui ne sont liés que de façon indirecte à la lésion originale. Les aberrations chromosomiques et les micronoyaux, par exemple, sont causés par des cassures de l'ADN, mais la structure visible en microscopie est le résultat d'une transformation cellulaire complexe. Le Comet assay et l'analyse de foci γ-H2AX cependant, offrent la possibilité de directement évaluer l'altération au niveau des cellules individuelles. Faisant partie du portfolio toxicologie, MetaSystems a automatisé ces deux tests avec Metafer.

Comet Assay

Le Comet assay (single cell gel electrophoresis en anglais) est une méthode pour obtenir la quantité d'ADN fragmenté de cellules individuelles. Elle est largement utilisée pour estimer l'altération de l'ADN causé par des produits chimiques ou par irradiation, par exemple pour tester la sensibilité individuelle aux radiations ionisantes chez les patients atteints du cancer. L'essai implique l'analyse d'image du motif de migration causé par l'ADN fragmenté dans un gel d'agarose. Plus l'ADN est fragmenté, plus de fragments d'ADN migrent, formant une structure qui ressemble à la queue d'une comète. La quantification de l'altération est ensuite basée sur le calcul de la <<tête>> (la cellule, en réalité) et de la <<queue>> (les fragments ayant migré).

Metafer détecte automatiquement et sélectionne des cellules dans des prélèvements <<single cell gel electrophoresis>>. Toutes les cellules sélectionnées sont analysées pour tous les features importants pour le Comet assay (tail moment, Olive tail moment, % d´ADN dans la queue, taille de la queue et de la tête et beaucoup d´autres). Les conditions de bruit de fond des images sont mesurées et les données obtenues en résultat peuvent être corrigées pour un fond inégal. Les comètes sont détectées sur la base de critères morphologiques définis par l´utilisateur et sur la base de seuils entre cellules et bruit de fond. Les comètes détectées sont affichées dans une galerie de cellules et chaque comète peut être relocalisée par un simple clic de souris. Les données sont affichées dans des histogrammes/des diagrammes de dispersion pratiques qui sont mis à jour en direct pendant le scan. Metafer permet des temps d'expositions multiples pour l'acquisition d'images pour créer des images avec une plage dynamique étendue pour des mesures plus précises et plus fiables.

Metafer est le système parfait pour l'analyse automatisée à haut-débit du Comet assay. Le système peut être adapté à différents formats de lames, comme par exemple aux lames multi-puits.

Dans le package Comet pour Metafer, une licence du logiciel d'analyse Comet interactif est également inclue. Ce logiciel met à dispositions les mêmes options d'analyse que Metafer et il est également disponible comme système autonome. Si les fonctionnalités d'analyse de signaux de Metafer sont utilisés, ceci donne bien plus d'options pour la sélection automatique des cellules cibles. Un tel système peut automatiquement détecter des Hedgehog Comets et distinguer leurs résultats de ceux d´autres cellules.

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Foci Gamma-H2AX

Les cassures double-brin de l´ADN (CDB) sont les lésions d'ADN les plus nuisibles qui, si elles ne sont pas réparées, peuvent avoir de sérieuses conséquences pour la survie de la cellule. Elles sont connues pour mener à des aberrations chromosomiques, à une instabilité génomique et à la mort cellulaire. De nombreux facteurs physiques, chimiques et biologiques sont impliqués dans l'induction des CDB. L'histone H2AX, une protéine qui contribue à la formation des nucléosomes et donc à la structure de l'ADN, est phosphorylé au niveau de la sérine 139, nommée ensuite γ-H2AX, comme réaction à la formation des CDB. Puisque γ -H2AX s'étend bien au-delà des sites CDB et comme des anticorps spécifiques pour γ-H2AX sont disponibles, les CDB peuvent être visualisés comme des focis distincts. La quantification de foci γ-H2AX peut être utilisée pour détecter l'effet génotoxique de différentes substances toxiques, ce qui inclut également la radiation ionisante.

Puisque les foci γ -H2AX foci apparaissent sous le microscope comme des signaux en forme de sphères, ils peuvent être analysés automatiquement en utilisant la fonctionnalité de comptage de Metafer. Cependant, contrairement aux signaux FISH, les foci γ-H2AX ont tendance à varier en taille et aussi à former des amas de marquage fluorescent dans les cellules exposées à des doses plus élevées d'un agent qui induit des CDB. Metafer compte des foci dans les noyaux directement et automatiquement, mais offre aussi la possibilité d'ajouter une pondération à la mesure. Ainsi, le logiciel permet l'adaptation des conditions de comptage aux propres standards de comptage. L'adaptation peut être faite en utilisant des données d'expériences de validation avec des courbes dose-effet valides.

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