Análisis de Micronúcleos

Análisis Automatizado de Micronúcleos

Análisis de muestras de micronúcleos (in-vitro e in-vivo) en Metafer para la investigación en biodosimetría, toxicología y mutagénesis.

Las pruebas de micronúcleos (MN) se utilizan en exámenes toxicológicos y en biodosimetría de radiación para cuantificar el daño genético causado por un agente determinado. Estos ensayos son hoy en día reconocidos como las pruebas más fiables para carcinógenos genotóxicos. Existen dos modelos principales de ensayos de MN: a) el ensayo de MN en bloqueo de citoquinesis (denominado también ensayo de MN in-vitro), y b) el ensayo de MN en eritrocitos de roedores (denominado también ensayo de MN in-vivo).

Metafer puede realizar captura y análisis de imágenes completos, automatizados, y fiables para ambas pruebas. El análisis automatizado de MN cumple con las respectivas directrices de la OCDE y puede realizarse de acuerdo con Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL).

Test MN in-vitro

El ensayo de micronúcleos en bloqueo de citoquinesis es un sistema completo para medir el daño del ADN, citostática y citotoxicidad. El ensayo consiste en añadir citocalasina-B (un inhibidor del huso mitótico que evita la citoquinesis) a los cultivos celulares. Como consecuencia, las células que han completado una división nuclear se identifican por su aspecto bi-nucleado. Los eventos de daño en el ADN se miden específicamente en estas células binucleadas.

Metafer escanea automáticamente las muestras de MN in-vitro, identifica de forma fiable las células binucleadas y las analiza para detectar la presencia de micronúcleos. Simultáneamente se cuentan todos los núcleos mononucleados, proporcionando información sobre la tasa de proliferación del cultivo.

Los resultados se disponen en una galería de imágenes que muestra cada célula analizada junto con su respectivo número de micronúcleos. Los datos se resumen en un histograma. Los usuarios pueden seleccionar las clases de células positivas, filtrar la galería por selección y, de este modo, confirmar rápidamente los resultados automatizados sin necesidad de reubicar las células bajo el microscopio. Las células y la morfología de los micronúcleos son analizadas en base a conjuntos de parámetros adaptables por el usuario. La optimización de los parámetros y el establecimiento de los estándares de medición se llevan a cabo con la ayuda de una herramienta automatizada de auto-optimización.

De esta forma, el contaje de micronúcleos en Metafer no sólo es muy robusto, sino extremadamente rápido. Se ha convertido en una herramienta crucial en el ámbito de la biodosimetría de radiaciones. Varios estudios renombrados e independientes en revistas importantes muestran que el contaje de MN en Metafer es la herramienta más capaz para la estimación de la dosis de radiación.

En toxicología, los efectos citostáticos del agente a ensayo son cuantificados evaluando la proporción de células mononucleadas, bi- y multi-nucleadas (CBPI). Este método también forma parte de la respectiva directriz de la OCDE (directriz nº 487 de la OCDE). Metafer analiza automáticamente el estado de las células mediante el análisis de morfología nuclear y calcula el CBPI. El sistema cumple totalmente con la mencionada directriz OCDE, y está en concordancia con la regulación de BPL.

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Test MN in-vivo

La prueba de MN in-vivo (ensayo MN de eritrocitos de roedores) normalmente utiliza médula ósea o sangre periférica de roedores que han sido tratados con la sustancia de prueba. Los glóbulos rojos de la muestra se clasifican como eritrocitos policromáticos (PCE; inmaduros) o normocromáticos (NCE; maduros). En el PCE los núcleos principales han sido extruidos, y el MN permanece en el citoplasma anucleado. Un aumento de la frecuencia de los eritrocitos policromáticos micronucleados en los animales tratados es una indicación de daño cromosómico inducido. PCE y NCE se distinguen por el color (después de aplicar una tinción de May-Gruenwald-Giemsa), y la proporción entre ambas poblaciones informa sobre retrasos en el ciclo célular debidos a efectos secundarios tóxicos del agente. Es importante saber que la automatización del ensayo de MN in-vivo requiere muestras preparadas a partir de soluciones celulares purificadas en columna, y que se recomienda preparar las muestras con citocentrifugación. Sólo así se puede asegurar un análisis automatizado fiable y sin errores.

La automatización de la prueba de MN in-vivo con Metafer se hace en un flujo de trabajo completamente autónomo. El sistema adquiere automáticamente imágenes de la muestra y analiza el rango de intensidad de la tinción. En referencia a la calidad de la tinción, el PCE y el NCE se distinguen automáticamente en función de su color. El sistema es suficientemente robusto para hacer frente a las diferentes calidades de tinción y a diferentes proporciones de PCE y NCE (por ejemplo, si se utiliza sangre periférica en lugar de médula ósea). Una vez que se definen los colores del PCE y el NCE, cada célula se asigna a una de las clases, y entonces se cuantifican los micronúcleos. El sistema es capaz de analizar más de 1.000 células por minuto.

La automatización de la prueba in-vivo de MN con Metafer cumple totalmente con la respectiva directriz de la OCDE (directriz nº 474 de la OCDE), y con el marco de regulación BPL.

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