Mikrokerne zählen

Automatiserte Mikronukleus Tests

Auf Metafer basierende Analyse von in-vitro und in-vivo Mikronukleus-Proben für Bio-Dosimetrie, Toxikologie und Mutagenitätsforschung.

Micronukleus (MN) (oder Mikrokern) Assays werden in toxikologischen Screenings und in der Strahlen-Biodosimetrie eingesetzt, um das DNA-schädigende Potenzial eines Agens zu quantifizieren. Die Assays gelten als die erfolgreichsten und verlässlichsten Tests für genotoxische Karzinogene. Es gibt zwei verschiedene MN-Assayvarianten, nämlich (a) den cytokinesis-block MN Assay (oder ‚in-vitro MN Assay’) und (b) den rodent erythrocyte MN Assay (oder ‚in-vivo MN Assay’).

Metafer kann alle Schritte von der Bildaufnahme bis hin zur Auswertung beider Tests unbeaufsichtigt und verlässlich durchführen. Die automatisierte MN Analyse ist konform mit den OECD-Richtlinien und kann in Übereinstimmung mit den Regeln der Good Laboratory Practices (GLP) durchgeführt werden.

in-vitro MN Test

Der ‚cytokinesis-block’ Mikronukleus Assay ist ein umfassendes System, um DNA-Schäden, Zytostase und Zytotoxizität zu messen. Der Assay beruht auf der Gabe von Cytochalasin-B (einem Inhibitor der Mitosespindel, der die Zytokinese unterbricht) zu Zellkulturen. Alle Zellen, die eine Kernteilung vollendet haben, erscheinen dann als zweikernig. DNA-Schäden werden gezielt an diesen zweikernigen Zellen nach einer Kernteilung untersucht.

Metafer durchsucht automatisch in-vitro MN Präparate, erkennt zuverlässig zweikernige Zellen (Zellen, die noch eine Kernteilung nach Gabe des Inhibitors vollenden konnten) und bestimmt die Anzahl der Zellen mit zusätzlichen Mikrokernen. Gleichzeitig werden auch noch alle einkernigen Zellen geszählt, um die Proliferationsrate der Zellkultur bestimmen zu können.

Die Ergebnisse der Analyse werden in einer Zellgalerie angezeigt, zusammen mit der Anzahl der Mikronuklei für jede einzelne Zelle.

Alle Daten werden in einem Histogramm zusammengefasst. Anwender können mit einem Klick auf die Klasse der Mikronukleus-positiven Zellen die Mikronukleus-negativen Zellen aus der Galerie ausblenden und so schnell die automatischen Zählergebnisse überpüfen, ohne alle Zellen zu berücksichtigen. Die Morphologie von Zellen und Mikronuklei werden auf der Basis von anpassbaren Parametern beurteilt. Die Optimierung der Parameter und damit der standardisierten Auswertekriterien gelingt mit der Hilfe einer automatisierten, selbst-optimierenden Software-Funktion. Die Auto-Optimierung kann auch für die Einstellung der besten Bildbearbeitungs-Parameter eingesetzt werden.

Die außerordentlich robuste und gleichzeitig sehr schnelle Micronukleus-Auswertung mit Metafer ist zu einem wichtigen Hilfsmittel in der Strahlen-Biodosimetrie geworden. Verschiedene unabhängige Studien in Fachjournalen haben gezeigt, dass die Mikonukleus-Auswertung mit Metafer sich sehr gut für die Abschätzung der Strahlenexposition eignet, besonders für Szenarien, bei denen ein großer Unfall mit ionisierender Strahlung ausgenommen wird.

In der Toxikologie wird der zytostatische Effekt einer Testsubstanz anhand des Verhältnisses von ein-, zwei- und vielkernigen Zellen (CBPI) bestimmt. Dieses Verfahren ist Teil der einschlägigen OECD-Richtlinie (OECD Richtlinie #487). Metafer bestimmt automatisch den Status der Zellen anhand einer morphologischen Analyse und berechnet daraus den CBPI. Das System erfüllt die Anforderungen der OECD-Richtlinie und der GLP-Regularien.

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in-vivo MN Test

Der in-vivo MN Test (‚rodent erythrocyte ’ MN Assay) verwendet in der Regel Knochenmark oder peripheres Blut von Nagetieren, die mit der Testsubstanz behandelt wurden.

Die roten Blutzellen der Probe weden entweder als polychromatische (PCE; unreife) oder normochromatische (NCE; reife) Erythrocyten klassifiziert. In PCE wurde der Hauptkern ausgestoßen, aber die MN verbleiben in dem ansonsten kernfreien Zytoplasma. Eine Häufung von PCE mit MN in behandelten Tieren ist ein Indikator für induzierte Chromosomenschäden. PCE und NCE können nach dem Grad ihrer Färbung (May-Gruenwald-Giemsa Färbung) unterschieden werden und das Verhältnis zwischen beiden Populationen gibt Auskunft über Verzögerungen im Zellzyklus durch toxische Nebeneffekte der Testsubstanz. Für die automatische Auswertung des in-vivo MN Tests ist es notwendig, die Zellproben durch Gradientenzentrifugation und Säulen aufzureinigen. Nur auf diese Weise hergestellte Präparate gewährleisten eine verlässliche automatisierte Analyse.

Metafer kann den in-vivo MN Test ohne einen Eingriff durch den Anwender ausführen. Das System nimmt automatisch Bilder auf und wertet die Färbungsintensität über einen weiten Bereich aus. In Relation zur Qualität der Färbung werden dann PCE und NCE aufgrund ihrer Farbgebung automatisch unterschieden. Das System ist so robust, dass es sowohl mit starken wie schwachen Färbungen als auch mit unterschiedlichen Verhältnissen von PCE zu NCE (peripheres Blut anstelle von Knochenmark) gut zurecht kommt. Sobald die Farbwerte für PCE und NCE bestimmt wurden, kann jede Zelle zu einer Klassen zugeordnet und die Mikronuklei gezählt werden. Typischerweise schafft es das System, etwa 1.000 Zellen pro Minute auszuwerten.

Die Automatisierung des in-vivo MN Tests mit Metafer entspricht den Vorgaben der OECD (OECD Richtlinie #474) und den Regularien für GLP.

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