Comet Assay / Foci

Einzelzell-basierte Analyse von DNA-Schäden

Automatisierung der Quantifizierung von DNA-Läsionen basierend auf Einzelzellen.

Toxikologen und Strahlenbiologen können heute zwischen verschiedenen etablierten Testverfahren auswählen, um die Schädigung von DNA zu bestimmen. In vielen dieser Tests werden jedoch Ereignisse gezählt, die nur indirekt mit der ursprünglichen Läsion verknüpft sind. Chromosomen-Aberrationen und Micronuklei werden zum Beispiel zwar durch DNA-Brüche hervorgerufen, die mikroskopisch sichtbaren Strukturen sind aber das Ergebnis komplexer zellulärer Prozesse.  Der Comet Aassay und die γ-H2AX Foci-Analyse bieten dagegen die Möglichkeit, das Ausmaß der DNA-Schäden direkt und auf der Ebene einzelner Zellen zu analysieren. Als Teil der Produktpalette für die Toxikologie bietet MetaSystems automatisierte Auswertemöglichkeiten auf der Basis von Metafer an.

Comet Assay

Der Comet Assay (auch bekannt als ‚single cell gel electrophoresis assay’) ist ein Verfahren mit dem das Ausmaß der DNA-Fragmentierung einer einelnen Zelle bestimmen kann. Es wird häufig eingesetzt, um die durch Strahlung und Chemikalien hervorgerufenen Schäden abzuschätzen, zum Beispiel um Krebspatienten individuell auf ihre Strahlenempfindlichkeit zu untersuchen. Die exponierten Zellen werden in ein Agarosegel auf einem Glas-Objektträger eingebettet und die Kern-DNA durch Elektrophorese der Größe nach aufgetrennt. Je stärker die DNA geschädigt ist, umso kleinere Fragment entstehen, die sich wiederum in der Elektrophorese am schnellsten vom Kern fortbewegen. Dies führt zu einer Struktur, die an einen Kometen (Zellkern) mit seinem Schweif (fragmentierte DNA) erinnert.

Metafer erkennt automatisch die ‚Kometen’ und bestimmt alle wichtigen Eigenschaften für den Comet Assay (‚tail moment’, ‚Olive tail moment’, %DNA im Schwanz, im Kopf, die Abmessungen des Kopfs, und viele weitere mehr). Der unspezifische Hintergrund wird ebenso bestimmt und alle Daten werden entsprechend korrigiert. Die ‚Kometen’ werden anhand von durch den Anwender festzulegende morphologische Kriterien und der Bildschwellen zwischen Komet und Hintergrund erkannt. Die erkannten ‚Kometen’ werden in einer Zellgalerie angezeigt, so dass der Kern mit einem Mausklick relokiert werden kann. Die Daten lassen sich in übersichtlichen Histogrammen oder Streudiagrammen darstellen, die kontinuierlich während des Scanvorgangs aktualisiert werden. Metafer unterstützt gestaffelte Belichtungsszeiten für die Bildaufnahme, um dem außerordentlichen Kontrastumfang der Präparate Rechnung zu tragen. Auf diese Weise wird vermieden, dass die Bilder gesättigte Bereiche aufweisen, und gewährleisen so präzise und verlässliche Messungen.

Metafer CometScan ist das perfekte System für die automatisierte Hochdurchsatz-Analyse von Comet Assays. Für Objektträger in Sonderformaten sind spezielle Präparatehalter erhältlich.

Metafer CometScan enthält außerdem eine Lizenz für die interaktive Comet Assay Auswertesoftware. Diese Software verfügt über die gleiche Auswerteoption wie die automatisierte Variante und ist auch als Einzelplatzversion (mit Kamera) erhältlich. Metafer verfügt allerdings noch über weitere Möglichkeiten, Bilder zu analysieren, die zum Beispiel auch für die automatische Unterscheidung von ‚Hedgehog Comets’ und anderen Zellen genutzt werden können.

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gamma-H2AX Foci

Doppelstrangbrüche (DSB) sind die schwerwiegendsten DNA-Schäden, die, wenn sie nicht repariert werden, äußerst nachteilige Konsequenzen für das Überleben einer Zelle haben. Es ist bekannt, dass DSB zu Chromosomen-Aberrationen, Genom-Instabilität und Zelltod führen können. Eine Reihe physikalischer, chemischer und biologischer Faktoren können in die Entstehung von DSB involviert sein. Das Histon H2AX, das wichtig für die Ausbildung der Nukleosomen und damit der Struktur der DNA ist, wird als Reaktion auf die Ausbildung eines DSB an der Aminosäure Serin-139 phosphoryliert. Das dann als γ-H2AX bezeichnete Protein häuft sich rund um einen DSB an. Mit fluoreszenz-markierten, spezifischen γ-H2AX-Antikörpern kann man DSB als diskrete Foci nachweisen. Die Quantifizierung der γ-H2AX-Foci erlaubt dann einen Nachweis des genotoxischen Effekts von Substanzen oder ionisierender Strahlung.

Da γ -H2AX-Foci im Mikroskop als punktförmige Signale erscheinen, lassen sie sich in Metafer automatisch zählen. Im Gegensatz zu den meisten FISH-Signalen, variieren die γ-H2AX-Foci über einen weiten Größenbereich und können sich auch bei hohen Dosen des DSB-induzierenden Agens zu Aggregaten zusammen lagern. Metafer zählt die Foci in Zellkernen automatisch und kann bei Bedarf einen Kompensations-Term für sehr große Foci in die Messung einfließen lassen. Die Art und Weise der automatischen Zählung kann an die im Labor verwendeten Kriterien angepasst werden. Für die Standardisierung eignen sich Daten aus Validierungs-Experimenten mit belastbaren Dosis-Effekt-Kurven.

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