Micronúcleos

Teste de Micronúcleo Automatizado

Análise de amostras de micronúcleos "in vitro" e "in vivo" para pesquisas em biodosimetria, toxicologia e mutagenicidade, baseada no software Metafer.

Os testes de micronúcleos (MN) são usados na triagem toxicológica e na biodosimetria de radiação para quantificar a capacidade de um agente em danificar o DNA. Os ensaios são agora reconhecidos como os mais bem-sucedidos e confiáveis teste para carcinógenos genotóxicos. Existem dois modelos principais de testes de MN, nomeados (a) teste de MN de bloqueio de citocinese (também conhecido como ensaio de MN "in-vitro") e (b) o ensaio de MN de eritrócitos de roedores  (também conhecido como Ensaio de MN "in-vivo").

O Metafer pode realizar aquisições e análises de imagens completas, de maneira autônoma e confiável nos dois testes. A análise automatizada de MN é compatível com as respectivas diretrizes da OCDE e pode ser realizada de acordo com as Boas Práticas de Laboratório (BPL).

Teste de MN "in-vitro"

O ensaio de micronúcleos de blocos de citocinese é um sistema abrangente para medir danos no DNA, citostase e citotoxicidade. O ensaio consiste em adicionar citocalasina-B (um inibidor do fuso mitótico que impede a citocinese) às culturas celulares. Como conseqüência, as células que completaram uma divisão nuclear são identificadas por sua aparência bi-nucleada. Os eventos de dano ao DNA são pontuados especificamente em células bi-nucleadas uma vez divididas.

O Metafer verifica automaticamente amostras de MN "in vitro", identifica de maneira confiável células bi-nucleadas (células que foram submetidas a uma separação de células após o tratamento) e as analisa quanto à presença de micronúcleos. Simultaneamente, todos os núcleos mononucleados são contados, fornecendo feedback sobre a taxa de proliferação da cultura.

Os resultados da análise são exibidos em uma galeria de células, mostrando cada célula analisada juntamente com a respectiva contagem de micronúcleos. Todos os dados são resumidos como histograma. Os usuários podem selecionar as classes de células positivas para micronúcleos, filtrar a galeria por seleção e, assim, confirmar rapidamente resultados automatizados sem a necessidade de rolar por todas as células. As morfologias de células e micronúcleos são analisadas com base em conjuntos de parâmetros adaptáveis ao usuário. A otimização dos parâmetros e, portanto, a definição dos padrões de pontuação são feitos com a ajuda de uma ferramenta de auto-otimização. A otimização automática também pode ser usada para encontrar os melhores parâmetros de processamento de imagem.

A pontuação de micronúcleos com o Metafer não é apenas altamente robusta, mas também extremamente rápida. Tornou-se uma ferramenta muito importante para a biodosimetria de radiação. Vários estudos independentes em periódicos revisados por pares demonstram que a pontuação de micronúcleos com o Metafer é uma ferramenta útil para a estimativa da dose de radiação, especialmente em cenários em que se presume um grande acidente envolvendo fontes de radiação ionizante.

Na toxicologia, os efeitos citostáticos do composto de teste são medidos através da avaliação da razão de células mono-, bi- e multi-nucleadas (CBPI). Este método também faz parte da respectiva diretriz da OCDE (diretriz da OCDE nº 487). Metafer analisa automaticamente o status das células por análise morfológica dos núcleos e calcula o CBPI. O sistema é totalmente compatível com as diretrizes da OCDE, e também com a estrutura de regulamentação das BPL.

Teste de MN in-vivo

O teste de MN "in-vivo" (ensaio de MN de eritrócito de roedores) normalmente utiliza medula óssea ou sangue periférico de roedores que foram tratados com a substância de teste. Os glóbulos vermelhos da amostra são classificados como policromáticos (PCE; imaturos) ou normocromáticos (NCE; maduros). Na PCE, os núcleos principais foram extrudados e o MN permanece para trás no citoplasma anucleado. Um aumento na frequência de eritrócitos policromáticos micronucleados em animais tratados é uma indicação de dano cromossômico induzido. PCE e NCE são distinguidos pela cor (após a aplicação da coloração de May-Gruenwald-Giemsa), e a proporção entre as duas populações traz informações sobre atrasos no ciclo celular devido a efeitos colaterais tóxicos do agente de teste. É importante saber que a automação de pontuação do teste MN in vivo requer amostras preparadas a partir de soluções celulares purificadas em coluna e que é recomendado preparar amostras com citocentrifugação. Somente essa maneira de preparar lâminas garante uma análise automatizada confiável e sem erros.

A automação do teste de MN in vivo com o Metafer é feita em um fluxo de trabalho completamente autônomo. O sistema adquire automaticamente imagens da amostra e analisa a faixa de intensidade da coloração. Com referência à qualidade da coloração, o PCE e o NCE são distinguidos automaticamente com base na cor. O sistema é robusto o suficiente para lidar com diferentes qualidades de coloração e com diferentes proporções de PCE e NCE (por exemplo, se sangue periférico for usado em vez de medula óssea). Uma vez definidas as cores PCE e NCE, cada célula é atribuída a uma das classes e os micronúcleos são detectados. Normalmente, o sistema varre e analisa mais de 1.000 células por minuto.

A automação do teste MN in vivo com o Metafer é totalmente compatível com a respectiva diretriz da OCDE (diretriz da OCDE nº 474) e com a estrutura de regulamentação das BPL.

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