Ensaio Cometa / Foci

Análise de Dano de DNA Baseado em Célula Única

Automação da análise quantitativa de lesões de DNA baseados em célula única.

Atualmente, toxicologistas e biólogos de radiação podem escolher entre muitos testes estabelecidos para avaliar os danos no DNA. No entanto, muitos desses testes são baseados na contagem de eventos que são indiretamente relacionados à lesão original. As aberrações cromossômicas e os micronúcleos, por exemplo, são causados por quebras de DNA, mas a estrutura microscopicamente visível é o resultado de um complexo processamento celular. O ensaio cometa e a análise de γ-H2AX foci, no entanto, têm a chance de avaliar diretamente o dano em um nível de celular. Como parte do portfólio de toxicologia, a MetaSystems automatizou os dois ensaios utilzando o Metafer.

Ensaio Cometa

O ensaio Comet (eletroforese em gel de célula única) é um método que visa obter a quantidade de fragmentação de DNA de células únicas. É amplamente utilizado para estimar danos no DNA causados por produtos químicos ou radiação, por exemplo, para testar sensibilidades individuais à radiação ionizante em pacientes com câncer. O ensaio envolve a análise de imagens do padrão de migração causado pela fragmentação do DNA, em um gel de agarose. Quanto mais fragmentado o DNA, mais os fragmentos de DNA migram, formando uma estrutura que se assemelha à cauda de um cometa. A quantificação de danos é então baseada no cálculo da 'cabeça' (a célula real) e da 'cauda' (os fragmentos migrados).

O Metafer automaticamente detecta e seleciona células em amostras de eletroforese em gel de célula única. Todas as células selecionadas são analisadas para todos os recursos mais importantes para o ensaio Cometa (tail moment, Olive tail moment,% de DNA na cauda, dimensões da cauda e da cabeça, e muito mais). As condições de fundo nas imagens são medidas e os dados dos resultados podem ser corrigidos quando fundo da imagem é irregular. Os cometas são detectados com base em critérios morfológicos definidos pelo usuário, como limites entre células e plano de fundo. Os cometas detectados são exibidos na galeria de células e cada cometa pode ser realocalizado com um único clique do mouse. Os dados são exibidos em histogramas e / ou gráficos de dispersão de fácil interpretação, que são atualizados continuamente à medida que a verificação avança. O Metafer suporta múltiplos tempos de exposição para aquisição de imagens. As Imagens possuem uma faixa dinâmica estendida para medições mais precisas e confiáveis.

O Metafer é o sistema perfeito para análises automatizadas de ensaios Cometa de alto rendimento (high-throughput). Ele tolera alterações nas dimensões das lâminas, por exemplo para o uso de amostras multi-gel.

O Metafer também inclui uma licença para o software interativo de análise de ensaios Cometa. O software fornece as mesmas opções de análise como o Metafer, e também está disponível como um sistema independente. Se os recursos de análise do Metafer forem usados, há muito mais opções para a seleção automatizada de células-alvo. Por exemplo, esse sistema pode detectar automaticamente os Cometas e distinguir seus resultados das outras células.

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gamma-H2AX Foci

As quebra da fita dupla (DSB) são as lesões de DNA mais deletérias que, se não forem reparadas, podem ter graves consequências para a sobrevivência celular. Eles são conhecidos por levar a aberrações cromossômicas, instabilidade genômica e morte celular. Vários fatores físicos, químicos e biológicos estão envolvidos na indução de DSB. A histona H2AX, uma proteína que contribui para a formação de nucleossomos e, portanto, a estrutura do DNA, torna-se fosforilada na serina 139, então chamada γ-H2AX, como uma reação à formação de DSBs. Como o γ-H2AX expande uma grande distância do local do DSB, e como os anticorpos específicos γ-H2AX estão disponíveis, os DSBs podem ser visualizados como focos discretos. A quantificação de focos γ-H2AX pode ser usada para detectar o efeito genotóxico de diferentes substâncias tóxicas, incluindo radiação ionizante.

Como os focos γ-H2AX aparecem microscopicamente como sinais em forma de ponto, eles podem ser analisados automaticamente usando a funcionalidade de contagem de sinais da Metafer. Em contraste com os pontos de FISH, no entanto, os focos de γ-H2AX tendem a variar de tamanho e também a se fundir em manchas maiores de coloração fluorescente em células expostas a doses mais altas de um agente indutor de DSB. O Metafer não só conta os focos nos núcleos celulares direta e automaticamente, mas também oferece a possibilidade de adicionar um termo de pesagem à medição. Assim, permite a adaptação das condições de pontuação aos próprios padrões de pontuação. A adaptação pode ser feita usando dados de experimentos de validação com curvas de dose-efeito válidas.

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